Яндекс.Метрика
 20.04.2023      617      0
 

Выделен ли вирус?


Автор: Кириченко Е.Н., генетик, химик широкого профиля, представитель Независимой ассоциации врачей

Первые сообщения о SARS-CoV-2

Цитата: «Секвенирование метагеномной РНК образца жидкости бронхоальвеолярного лаважа, полученного от пациента, выявило новый штамм РНК-вируса из семейства коронавирусов». [1].

Однако в действительности была проведена следующая работа: секвенировано 56 565 928 последовательностей, которые были собраны de novo и проверены на потенциальные этиологические агенты. Всего было получено 384 096 таких контигов (искусственно созданных последовательностей в процессе сборки). Самый длинный из них – 30 474 нуклеотидов, – был обнаружен в наиболее высокой концентрации, и его нуклеотидная последовательность на 89,1% совпадала с последовательностями группы SARS-подобных коронавирусов.

Таким образом, новый штамм коронавируса (геном, окруженный мембраной с S-белками) не был выделен из легочной жидкости пациентов, страдающих от предположительно нового заболевания. Была получена лишь некая искусственно собранная последовательность, напоминающая SARS-подобные вирусы. Это означает, что причинно-следственная связь между новыми штаммом коронавируса SARS-CoV-2 и неким заболеванием, обозначенным, как COVID-19 не была доказана.

Что такое ПЦР?

Для того, чтобы перейти к разбору других публикаций, заявляющих о выделении SARS-CoV-2, необходимо понять, что такое ПЦР-тестирование, поскольку в реальности вся диагностика COVID-19 сводится к положительному ПЦР-тесту.

В настоящее время COVID-19, согласно заявлениям Минздрава РФ, Роспотребнадзора, а также многих врачей из «красной зоны», описан как заболевание без специфических симптомов, которое может протекать у разных людей по-разному.

Аббревиатура ПЦР означает «полимеразная цепная реакция». Ключевое слово здесь «реакция». Набор реагентов уже содержит всё необходимое, чтобы синтезировать то, что мы ищем, весь вопрос только в подходящих условиях и количестве циклов.

В мае 2020 г. группа английских учёных опубликовали работу, в которой проверили корреляцию между количеством циклов, на которых был получен положительный результат ПЦР-тестирования, и достоверностью этих данных, согласно результатам посевов. Как оказалось, посевы жидкостей больных с диагнозом COVID-19, согласно положительному ПЦР-тесту на клетках Vero E6, не всегда демонстрируют цитопатический эффект (дегенеративные изменения в клеточных культурах). В работе было использовано 324 образца от 253 пациентов.

В результате исследования было установлено, что достоверность результатов ПЦР от 1 до 25 цикла составляет примерно от 100 до 80%, а от 25 до 35 циклов падает фактически до 0, результаты, полученные от 35 цикла и далее и вовсе нельзя считать достоверными. Кроме того, авторы работы обращают внимание, что ПЦР-тест, даже если он положителен, не позволяет определить, инфицирован человек или нет. Точно также, как не удалось найти зависимость между количеством циклов, с которых получен положительный результат, и тяжестью заболевания (от бессимптомных до среднетяжелых различий в количестве циклов не было), в то время как ПЦР метод полуколичественный. [2].

Это напрямую демонстрирует, что тяжесть заболевания не зависит от количества обнаруженных вирусных частиц. А это значит, что на самом деле болезнь может быть либо индуцирована любым другим патогеном, либо проблема заключается в гипериммунном ответе организма на контакт с любым SARS-подобным коронавирусом.

Кстати говоря, в регистрационном удостоверении № РЗН 2020/9948 от 13 июля 2021 г для одной из таких тест систем прописано: «регистрационное удостоверение на медицинское изделие, набор реагентов для выявления РНК коронавирусов SARS-CoV-2 и подобных SARS-CoV методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (SARS-CoV-2/ SARS-CoV) по ТУ 21.20.23-116-4648062-2020». Что подтверждает отсутствие специфичности таких тест-систем.

По факту получается, что диагноз COVID-19 на основании положительного ПЦР ставить нельзя, так как COVID-19, предположительно, вызывает именно SARS-CoV-2, тогда, как SARS-подобные существовали задолго до 2019 г и не вызывали никаких особо опасных заболеваний.

Спустя почти 2 года

PubMed по запросу «sars cov-2 isolation from patient» выдает 8 публикаций. Именно на них ссылается институт им. Гамалеи, утверждая, что вирус выделен.

1 публикация
«Вирусная РНК была обнаружена во многих органах у пациентов с COVID-19. Однако ранее инфекционный SARS-CoV-2 был изолирован только из респираторных образцов. В данной работе вирус SARS-CoV-2 был успешно выделен из мочи пациента, страдающего COVID-19. Выделенный вирус инфицировал клетки Vero и был распознан сывороткой пациентов, из мочи которого этот вирус выделили. Следует принимать соответствующие меры предосторожности, чтобы избежать передачи инфекции с мочой». [3].

Здесь речь идёт о 72-летнем мужчине, который недавно вернулся из Ухани и был госпитализирован с признаками ОРЗ. ПЦР-тест дал положительный результат, на КТ наблюдалось «матовое стекло». На 3-й день после госпитализации пациент был переведен на ИВЛ. Пациент имел высокий уровень антител, SARSCoV-2-специфических IgM, на раннем этапе заболевания, который со временем снижался, в то время как уровень антител IgG оставался относительно стабильным.

На 12 день после заражения методом ПЦР вирус SARS-CoV-2 был обнаружен в моче. Вирусная нагрузка в моче была низкой, вирус удалось определить на 12-й и 42-ой день, однако не удалось обнаружить на 30-й день. Образцы мочи были нанесены на клетки Vero E6, после чего на 3-й день наблюдался цитопатический эффект (возникновение дегенеративных изменений в клеточных культурах). Полноразмерная последовательность вирусного генома была получена с помощью методов секвенирования нового поколения с 5 нуклеотидными мутациями по сравнению к оригинальному уханьскому вирусу (https://ru.wikipedia.org/wiki/).

Супернатант клеточной культуры был визуализирован с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ): частицы сферической формы с отчётливыми выступами на поверхности, напоминающими шипы, по мнению авторов соответствовали вирионам SARS-CoV-2.

Содержимое супернатанта было перенесено на свежие клетки Vero E6, затем к одному из образцов добавили сыворотку крови пациента, а к другому сыворотку крови здорового донора. И методом иммунофлуоресцентного анализа установили связывание в образце с сывороткой крови пациента.

Таким образом, вирус не был выделен из образцов мочи больного. Хотя биологический материал больного обладает патогенными свойствами и вызывает цитопатический эффект на клетках Vero, оснований для заявления, что это происходит благодаря вирусу SARS-CoV-2, недостаточно. Супернатант, содержащий вирусоподобные частицы, был выделен уже с клеточной культуры Vero, а не из жидкостей больного. Изображения, получаемые с помощью просвечивающей электронной микроскопии, не позволяют установить наличие того или иного штамма. Любой представитель коронавирусного семейства в микроскоп будет выглядеть примерно одинаково. Кроме того, коронавирусы – это не единственные вирусы с «шипами». Выраженные структуры в виде отростков на липопротеиновой оболочке, окружающей вирион, называются пепломеры, их можно наблюдать и на других вирусах, например, цитомегаловирус (https://ru.wikipedia.org/wiki/).

Здесь же неплохо было бы упомянуть вскользь и об экзосомах – внеклеточных везикулах, продуцируемых клетками различных органов и тканей, которые под микроскопом также визуально напоминают колобков с шипами.

Методы геномного секвенирования — это достаточно сложные процессы, при неправильном проведении исследования может произойти ряд неточностей и погрешностей даже при использовании отработанной методики. Так, например, пресловутый тест на отцовство не дает 100% гарантии, а носит лишь вероятностный характер. Тем не менее, методы геномного секвенирования – это, бесспорно, одно из значимых достижений современной науки. Однако про достоверность результатов, полученных с помощью этих методов, можно говорить лишь в случае исследования чистых образцов при сходимости и воспроизводимости результатов. В то время как жидкости больного содержат слишком большие наборы генетического материала и вирусного, и бактериального происхождения, а также мРНК-генома самого пациента.

Супернатант, полученный с клеточных культур снова был нанесен на свежие клетки Vero и распознан сывороткой крови пациента. Конкретно этот эксперимент больше напоминает фокус с кроликом в шляпе: чтобы вынуть кролика из шляпы, его прежде надо туда посадить. Пациент был госпитализирован с признаками ОРЗ и его состояние затем ухудшилось, разумеется, что он болел и его биологические жидкости представляли собой патогенный биоматериал, при этом его кровь уже имела какие-то антитела в ответ на заболевание. Поэтому в том, что сыворотка крови этого пациента распознала патогенный материал, нет ничего удивительного. Сравнение стоило проводить не с сывороткой крови здорового донора, а с сыворотками крови других пациентов с диагнозом COVID-19.

Нисколько не желая обидеть авторов работы, разбор которой представлен выше, работа проведена большая и серьезная, но нельзя не отметить, что вирион SARS-CoV-2 по-прежнему не выделен. Методы, описанные выше, лишь косвенно указывают на возможность присутствия в биологических жидкостях больного SARS-подобных частиц, и никак при этом не доказывают причинно-следственную связь вируса с заболеванием. Интересно, какие результаты удалось бы получить аналогичным способом, если бы параллельно велось ПЦР-тестирование на другие патогены, например, на вирус гриппа А?

2 публикация
«Первый зарегистрированный случай заболевания COVID-19 в Австралии, изоляция, полногеномное секвенирование, визуализация и быстрое распространение вируса от пациента». [4].

Аналогичная описанной выше история. Мужчина 58 лет вернулся из Ухани, госпитализирован с признаками ОРЗ 19 января 2020 г. Диагноз COVID-19 установлен на основании метода ПЦР.

Далее под копирку: высеивание жидкостей больного на клетки Vero, супернатант рассмотрели в электронный микроскоп, геном вируса секвенировали, совпадение с SARS-CoV-2 99,99%.

На всех фото представлены экзосомы, выделяемые клеткой, которые и выдают за вирусы.

3 публикация
«Выделение вируса от первого пациента с SARS-CoV-2 в Кореи». Всё то же самое. «Цитопатический эффект наблюдали на клетках Vero после первого слепого пассажа. Наличие коронавируса было подтверждено с помощью электронного микроскопа, так как на изображении видны были сферические частицы с бахромой, напоминающие корону. Филогенетический анализ последовательности цельного генома показал сходство с SARS-CoV-2». [5].

Здесь следует отметить правдивое заявление о слепом пассаже. Пассаж (пассирование) – это многократная естественная или искусственная смена микроорганизмом (или патогеном, в данном случае вирусом) среды обитания. При пассаже всегда есть риск принять патоген из среды обитания за патоген, присутствующий в пробе. Что, судя по всему, и происходит. Все исследования, связанные с выделением вируса SARS-CoV-2 выполняют слепой пассаж (без выделения вируса непосредственно из жидкостей больного) на одной и той же клеточной линии, на клетках Vero, а потом рассматривают сферические частицы с бахромой, и секвенируют схожие геномы.

Однако жидкости, полученные от больных с респираторными симптомами, естественно содержат какие-то патогены, которые и вызывают цитопатический эффект на клетках Vero. Сферические частицы, находящиеся в супернатанте могут быть частицами, выделяемыми клетками Vero в ответ на «раздражитель». Это предположение, но очень правдоподобное.

4 публикация
«Итальянка 65 лет вернулась домой из Ухани 23 января 2020 г. Респираторные симптомы, тошнота и рвота. Диагноз на основании ПЦР. На 3-й день развился конъюнктивит, поэтому взяли пробы из глаз, которые также дали положительный результат ПЦР. Снова слепой пассаж образцов из глаз на клетки Vero. Наблюдение цитопатического эффекта и повторный ПЦР уже с жидкости над этими клетками». [6].

5 публикация
«Первый пациент из США. Образцы брали из носоглотки и ротоглотки. Мы обнаружили, что вирус реплицируется с высоким титром в клетках Vero-CCL81 и Vero E6 в отсутствие трипсина». [7].

6 публикация
«Методом ПЦР исследовали воздух в палате, где находилось 9 пациентов с диагнозом COVID-19. Восемьдесят восемь образцов были собраны с поверхностей и полов в палате и туалете, а также с простыней на кроватях больных. Все пробы показали отрицательный ПЦР. Пятьдесят пять образцов, взятых из СИЗ персонала, также были отрицательными». [8].

Эта работа очень интересная в отношении необоснованных жестких требований под угрозой штрафа носить медицинскую или тряпичную маску на лице, даже если не контактируешь с больными, а также относительно опасности нахождения в «красной зоне».

7 публикация
Следующее исследование посвящено вопросу, можно ли заразиться коронавирусом в замкнутом пространстве, например, в машине. Человек с положительным ПЦР 15 минут дышал внутри салона автомобиля, затем был сделан забор воздуха, этот образец воздуха дал положительный результат на ПЦР, что в общем-то абсолютно ожидаемо. [9].

Из полученных результатов авторы сделали предположение, что в машине вполне можно заразиться, однако, напоминаем, что наличие положительного теста не доказывает того, что человек инфицирован.

8 публикация
«Можно ли выделить вирус SARS-CoV-2 из фекалий? И снова пассаж на клетки Vero E6, 106 образцов от 46 пациентов. Два образца от одного пациента дали положительный результат. Этот пациент перенес трансплантацию почки и был подвергнут иммуносупрессивной терапии». [10].
Следует отметить, что авторы работы, которая так здорово разоблачает недостатки ПЦР метода как диагностики [2], также вскользь упоминают о выделении вируса, используя для это все те же клетки Vero.

Результаты запросов на документы, подтверждающие выделение вируса

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» на запрос предоставить хоть какие-нибудь документы, ссылки или статьи, подтверждающие выделение вируса, предоставил ссылку на ВОЗ. Необходимой информации найти там не удалось.

ФНЦИРИП им. Чумакова в ответ на тот же запрос дал ссылку на их же работу «Выделение и филогенетический анализ вариантов sars-cov-2, собранных в России во время вспышки COVID-19», опубликованную в октябре 2020 г. Метод «выделения» культивированного вируса такой же, как и в 9 вышеописанных публикациях.

Резюмируя всё вышесказанное, особо отметим, что для того чтобы с уверенностью утверждать, что новый штамм коронавирусной инфекции SARS-CoV-2, вызывающий особо опасное заболевание COVID-19, выделен, этот вирус необходимо выделить непосредственно из жидкостей больного, после чего заразить этим патогеном здорового человека и получить те же симптомы, снова выделить патоген из жидкостей экспериментального больного и сравнить эти два патогена. После этого вирус можно культивировать.

Однако проделать эти исследования не представляется никакой возможности, потому что в Ухани в конце 2019 г. случилась вспышка атипичной пневмонии, а заражая здорового человека любым штаммом коронавируса, ничего, кроме ОРВИ, получить не удастся. За одним единственным исключением: если этот человек предварительно был вакцинирован против новой коронавирусной инфекции или по какой-то причине имел высокий титр антител. Эксперименты по заражению вакцинированных испытуемых, насколько нам известно, на сегодняшний день не были проведены ни одним из разработчиков иммунопрофилактических препаратов против новой коронавирусной инфекции.

Список литературы

1. Wu F., Zhao S., Yu B., Yan-Mei Chen, Wang W., Zhi-Gang Song, Hu Y., Zhao-Wu Tao, Jun-Hua Tian, Yuan-Yuan Pei, Ming-Li Yuan, Yu-Ling Zhang, Fa-Hui Dai, Yi Liu, Qi-Min Wang, Jiao-Jiao Zheng, Lin Xu, Edward C Holmes, Yong-Zhen Zhang. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. // Nature. 2020. Mar. T. 579. №7798. P. 265-269. DOI: 10.1038/s41586-020-2008-3. [PMID: 32015508]

2. Anika Singanayagam, Monika Patel, Andre Charlett, Jamie Lopez Bernal, Vanessa Saliba, Joanna Ellis, Shamez Ladhani, Maria Zambon, Robin Gopal. Duration of infectiousness and correlation with RT-PCR cycle threshold values in cases of COVID-19, England, January to May 2020. Euro Surveill. 2020 Aug;25(32):2001483. doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.32.2001483. [PMID:32794447]

3. Sun J, Zhu A, Li H, Zheng K, Zhuang Z, Chen Z, Shi Y, Zhang Z, Chen SB, Liu X, Dai J, Li X, Huang S, Huang X, Luo L, Wen L, Zhuo J, Li Y, Wang Y, Zhang L, Zhang Y, Li F, Feng L, Chen X, Zhong N, Yang Z, Huang J, Zhao J, Li YM. Isolation of infectious SARS-CoV-2 from urine of a COVID-19 patient. Emerg Microbes Infect. 2020 Dec;9(1):991-993. doi: 10.1080/22221751.2020.1760144. [PMID: 32342724]

4. Caly L, Druce J, Roberts J, Bond K, Tran T, Kostecki R, Yoga Y, Naughton W, Taiaroa G, Seemann T, Schultz MB, Howden BP, Korman TM, Lewin SR, Williamson DA, Catton MG. Isolation and rapid sharing of the 2019 novel coronavirus (SARS-CoV-2) from the first patient diagnosed with COVID-19 in Australia. Med J Aust. 2020 Jun;212(10):459-462. doi: 10.5694/mja2.50569. Epub 2020 Apr 1. [PMID: 32237278]

5. Park WB, Kwon NJ, Choi SJ, Kang CK, Choe PG, Kim JY, Yun J, Lee GW, Seong MW, Kim NJ, Seo JS, Oh. Virus Isolation from the First Patient with SARS-CoV-2 in Korea. J Korean Med Sci. 2020 Feb 24;35(7):e84. doi: 10.3346/jkms.2020.35.e84. [PMID: 32080990]

6. Colavita F, Lapa D, Carletti F, Lalle E, Bordi L, Marsella P, Nicastri E, Bevilacqua N, Giancola ML, Corpolongo A, Ippolito G, Capobianchi MR, Castilletti C. SARS-CoV-2 Isolation From Ocular Secretions of a Patient With COVID-19 in Italy With Prolonged Viral RNA Detection. Ann Intern Med. 2020 Aug 4;173(3):242-243. doi: 10.7326/M20-1176. [PMID: 32302380]

7. Harcourt J, Tamin A, Lu X, Kamili S, Sakthivel SK, Murray J, Queen K, Tao Y, Paden CR, Zhang J, Li Y, Uehara A, Wang H, Goldsmith C, Bullock HA, Wang L, Whitaker B, Lynch B, Gautam R, Schindewolf C, Lokugamage KG, Scharton D, Plante JA, Mirchandani D, Widen SG, Narayanan K, Makino S, Ksiazek TG, Plante KS, Weaver SC, Lindstrom S, Tong S, Menachery VD, Thornburg NJ. Isolation and characterization of SARS-CoV-2 from the first US COVID-19 patient. bioRxiv. 2020 Mar 7;2020.03.02.972935. doi: 10.1101/2020.03.02.972935. Preprint [PMID: 32511316]

8. Wei L, Huang W, Lu X, Wang Y, Cheng L, Deng R, Long H, Zong Z. Contamination of SARS-CoV-2 in patient surroundings and on personal protective equipment in a non-ICU isolation ward for COVID-19 patients with prolonged PCR positive status. Antimicrob Resist Infect Control. 2020 Oct 29;9(1):167. doi: 10.1186/s13756-020-00839-x. [PMID: 33121538]

9. Lednicky JA, Lauzardo M, Alam MM, Elbadry MA, Stephenson CJ, Gibson JC, Morris JG Jr. Isolation of SARS-CoV-2 from the air in a car driven by a COVID patient with mild illness. Int J Infect Dis. 2021 Jul;108:212-216. doi: 10.1016/j.ijid.2021.04.063. Epub 2021 Apr 24. [PMID: 33901650]
10. Dergham J, Delerce J, Bedotto M, La Scola B, Moal V. Isolation of Viable SARS-CoV-2 Virus from Feces of an Immunocompromised Patient Suggesting a Possible Fecal Mode of Transmission. J Clin Med. 2021 Jun 18;10(12):2696. doi: 10.3390/jcm10122696. [PMID: 34207314]


Ваш комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Достигнут лимит времени. Пожалуйста, введите CAPTCHA снова.

Для отправки комментария, поставьте отметку, что разрешаете сбор и обработку ваших персональных данных . Политика конфиденциальности